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MSNs-IL-4对巨噬细胞的生物学性能影响的探讨

点击数: 2022-01-29 19:32 作者:www.shuoboxiezuo.com 来源:未知

关键词:MSNs-IL-4,噬细胞,生物学,性能,响的,探讨,MSN
MSNs-IL-4对巨噬细胞的生物学性能影响的探讨
通过在改良溶胶-凝胶法合成 MCM-41 型 MSNs,并对其负载 IL-4。通过 EDX 元素分析、小角 X 射线衍射、BET、透射电镜、扫描电镜对所合材料进行表征。通过 CCK8、免疫荧光、PCR 等实验研究 MSNs 和 MSNs-IL-4 对 Raw 264.7 巨噬细胞生物学特性的影响。
 
第 1 章 绪论
 
1.1 炎症和免疫应答
免疫系统在感染或损伤后受损组织的修复和再生中起着核心作用。在组织损伤过程中,死细胞或入侵的病原体分别释放损伤相关分子模式或病原体相关分子模式[50]。这些分子被模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRRs)识别,PRRs 主要由固有免疫细胞表达,激活组织常驻巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞以及其他局部细胞(如成纤维细胞和内皮细胞)的炎症信号通路[51]。这些细胞的激活导致各种促炎因子和细胞因子的释放,诱导其他固有免疫细胞向损伤部位定向趋化[28]。
免疫细胞在免疫系统对抗炎症中起着关键作用,包括中性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞、T 细胞、单核细胞和巨噬细胞[52]。中性粒细胞通常很快聚集到损伤处,吞噬病原体并清除污染物,通过分泌各种细胞因子和生长因子吸引其他免疫细胞,如第二波中性粒细胞和巨噬细胞[53-56]。树突状细胞是参与抗原物质吞噬和组织愈合过程的抗原提呈细胞[57]。T 细胞具有多种亚型,尽管不同亚型的具体功能和机制尚未明确,但已有大量证据表明 T 细胞可能参与细胞因子的产生和组织修复[58]。虽然免疫应答涉及多种免疫细胞类型,但巨噬细胞在组织重建中发挥最重要的作用,其可以分泌多种细胞因子,吞噬有害物质并招募其他细胞到损伤部位[59]。巨噬细胞既可以来自组织驻留的巨噬细胞群,也可以来自组织损伤期间血液循环单核细胞的招募和分化, 后者被认为是组织愈合过程中巨噬细胞的主要来源[60, 61]。血液循环中的单核细胞通常在损伤初期到达损伤部位并分化为巨噬细胞,损伤后 4~7 天巨噬细胞数目累积到达高峰期[62]。
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1.2 生物材料的免疫调节作用
生物材料可以为损伤组织提供结构支持,作为药物、生长因子、基因和细胞等分子的载体,在组织工程中得到了广泛的应用[26, 69]。植入物和组织工程结构周围的免疫调节可以通过的不同策略来实现,包括(i)改变生物材料宿主界面的物理性质,(ii)改变生物材料的表面化学性质,(iii)控制生物材料中抗炎或促炎细胞因子的释放[70]。他们证明了在不添加外源性细胞因子的情况下,细胞形态的伸长增强了白细胞介素-4 和白细胞介素-13 的 M2 诱导效果,同时抑制了它们对干扰素-g 和脂多糖等刺激的反应[74]。生物材料的表面电荷是调节免疫反应的另一个重要因素。表面带正电荷的粒子相比于带负电荷的粒子可激活更多的炎症小体(一种激活先天免疫系统促炎信号级联反应的多蛋白复合物)[75-77]。带有负电荷的粒子可以通过阻止抗原呈递细胞摄取这些物质来抑制免疫功能,从而完全消除抗体和 T 细胞反应[78]。而两性离子基序具有激活单核细胞和树突状细胞的能力(诱导细胞上调 MHC II 类和共刺激分子并产生细胞因子)[79],可抑制炎症反应和纤维化包膜的生成,并将巨噬细胞转移至 M2 表型[80]。
他们证明了在不添加外源性细胞因子的情况下,通过使用微图案化的基底,此外,细胞形态的伸长增强了白细胞介素-4 和白细胞介素-13 的 M2 诱导效果,同时抑制了它们对干扰素-g 和脂多糖等刺激的反应[74]。生物材料的表面电荷是调节免疫反应的另一个重要因素。表面带正电荷的粒子相比于带负电荷的粒子可激活更多的炎症小体(一种激活先天免疫系统促炎信号级联反应的多蛋白复合物)[75-77]。带有负电荷的粒子可以通过阻止抗原呈递细胞摄取这些物质来抑制免疫功能,从而完全消除抗体和 T 细胞反应[78]。而两性离子基序具有激活单核细胞和树突状细胞的能力(诱导细胞上调 MHC II 类和共刺激分子并产生细胞因子)[79],可抑制炎症反应和纤维化包膜的生成,并将巨噬细胞转移至 M2 表型[80]。
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第 2 章 材料与方法
 
2.1 实验设备与材料
2.1.1 实验设备
医学论文参考
医学论文参考
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2.2 实验方法
2.2.1 MSNs 的制备
将 1.0 g 的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和 3.5 mL  的 2.0 MNaOH 溶解在 480 mL  的水中,并在 80°C 下剧烈搅拌 2 小时,然后向溶液中加入 7.0mL 扩孔剂 1,3,5 一三甲基苯(TMB)。随后向溶液中滴加 5.0mL 正硅酸乙酯(TEOS),在 80℃下剧烈搅拌 2h。离心后得到沉淀物,用乙醇洗涤后在 60℃下干燥。为除去 CTAB 和均三甲苯,将 1.0g 制备的材料加入 200mL 乙酸乙醇溶液中,并在50℃下搅拌 48h。每个步骤在相同的受控条件下重复多次。
2.2.2 MSNs-IL-4 的制备
将 5μg IL-4 溶于 400μl 去离子水中,然后将 10mg MSNs 在冰上超声分散于溶液中。将溶液离心得到的沉淀用去离子水洗涤几次,冷冻干燥。
2.2.3 MSNs 和 MSNs-IL-4 的表征
通过 EDAX Genesis 2000X 射线能谱仪进行元素分析;使用D/max 2500 PC 型 X 射线衍射仪对样品进行结构分析;氮气吸附-脱附曲线由 Micromeritics ASAP 2020 Plus 比表面积/孔隙分析仪记录;使用 Brunauer-Emmett-Teller(BET)算法和 Barrett-Joyner-Halenda(BJH)模型在相对压力(P/P0)范围为 0.05-0.30 的范围内计算材料的比表面积,孔体积和孔径;使用在 200 kV 加速电压下运行的JEM-2200FS 透射电子显微镜(TEM)获取样品的 TEM 图像;使用S-4800 扫描电子显微镜(SEM)获得样品的 SEM 图像。
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第 3 章 实验结果................................................. 14
3.1 MSNs 和 MSNs-IL-4 的表征................................14
3.2 Raw 264.7 细胞活性检测.....................................16
3.3 Raw 264.7 细胞形态检测.......................................17
3.4 Raw 264.7 细胞基因表达分析.............................18
3.5 HUVECs 的基因表达分析..........................19
第 4 章 讨论.............................................21
第 5 章 结论........................................26
 
第 4 章 讨论
 
 
炎症在骨损伤的修复和再生中具有重要的作用[1, 129]。宿主对于骨替代材料的免疫反应已受到越来越多的关注[130, 131]。这些研究主要集中于探索影响巨噬细胞的材料的表面修饰,例如表面形貌,孔隙率和离子释放[132-135]。然而受到复杂的生物环境的影响,材料特性不能准确地调节材料-宿主反应。IL-4 是巨噬细胞极化的关键调节因子,据报道,适量的 IL-4 可以产生最理想的 M1/M2 型巨噬细胞转化 [1] ,但是由于在体内半衰期较短而限制其应用。MSNs 是一种有效的纳米载体,可大量负载细胞因子或其他生物大分子后靶向传递给细胞或组织并在体内维持和延长负载药物的生物活性。本实验将IL-4 负载于 MCM-41 型介孔二氧化硅纳米粒子,探讨 MSNs-IL-4 对巨噬细胞 Raw 264.7 细胞毒性、细胞形态和基因表达的影响,以期在细胞水平和分子水平上研究 MSNs-IL-4 对 Raw 264.7 细胞免疫调节作用的影响。
为了合成介孔二氧化硅纳米粒子,研究者们通常以表面活性剂为模板,在有机或无机水相中形成自组装或协同组装,通过溶胶凝胶或乳化等方法形成由无机二氧化硅聚集体包裹的胶束组装体,经煅烧或萃取除去有机模板剂后得到具有无机纳米骨架的介孔二氧化硅材料[136]。使用不同的合成方法或者实验条件改变,都会使合成的介孔硅的孔径、孔道结构、表面功能化等特征发生改变,而这些差异性表征往往都会影响介孔硅载药性能以及靶标位置[102]。
由于 MSN 良好的结构特性,如巨大的比表面积和孔容,使其具有较高的药物装载量和担载效率,并可通过调控表面化学特性,孔径大小,聚合物涂层使药物得到缓释[137, 138]。孔径和孔容在药物释放速率和载药能力的测定中起着重要作用。一般来说,较小的孔径和孔容导致药物载药量较低,释放速率较慢,这主要是由于溶剂向直径较小的介孔的扩散速率较慢[139]。CTAB 模板法制备的介孔二氧化硅纳米粒子孔径通常小于 3nm,适合小分子药物应用,但不足以包封大分子(如 DNA、RNA 和蛋白质)[139, 140]。
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第 5 章 结论
 
 
本实验中,我们通过在改良溶胶-凝胶法合成 MCM-41 型 MSNs,并对其负载 IL-4。通过 EDX 元素分析、小角 X 射线衍射、BET、透射电镜、扫描电镜对所合材料进行表征。通过 CCK8、免疫荧光、PCR 等实验研究 MSNs 和 MSNs-IL-4 对 Raw 264.7 巨噬细胞生物学特性的影响。结果显示:
1. 根据 EDX 元素分析 Si 占该材料重量的 55.14%,O 占该材料重量的 44.86%,证明了合成的介孔二氧化硅纳米粒子具有较好的纯度。
2. SAXRD 图谱显示出一个强峰和两个弱峰,证明合成的MCM-41 型 MSN 具有六方介孔结构。
3. MSNs 的等温曲线为典型 IV 型吸附脱附曲线,提示样品具有中孔结构。 经计算 MCM-41 的比表面积,孔容积和孔径分别为1,037.9497 m²/g, 1.626754 m2/g, 6.2691 nm,证明样品具有良好的载药能力。
4. TEM 和 SEM 形貌表征显示 MSNs 具有介孔通道和典型的六边形孔隙且粒径分布均匀,负载 IL-4 后,通道被填充并变的无序,证明药物成功负载。
5. CCK8 实验证实 MSNs-IL-4 可以促进 Raw 264.7 细胞的增殖。
6. 免疫荧光染色证实 MSNs-IL-4 可以刺激 Raw 264.7 细胞微丝结构重排、聚合,发生改建。
7. PCR 实验结果显示 MSNs-IL-4 可以升高 Raw 264.7 细胞 M2型相关基因 Tgfb1,IL-1ra,Arg-1 的表达,降低 M1 型相关基因 IL-6 的表达;MSNs-IL-4/Raw 264.7 条件培养基可以刺激 HUVECs 血管生长因子 MMP9 基因表达水平升高。说明 MSNs-IL-4 可以促进M2 型巨噬细胞的转化,产生有利于组织再生的免疫微环境。
参考文献(略)
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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